ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ЭРИТРОПОЭТИНА НА КЛЕТКИ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА В КУЛЬТУРЕ

Емельянова Е.А.

Институт биологии развития им.  Н.К. Кольцова РАН, Москва

Цель работы: Изучить действие эритропоэтина человека на  пролиферацию,  жизнеспособность  и  функциональную  актив­ность клеток кожи человека в культуре.

Материалы и методы. В исследованиях использовали линию  эпидермальных кератиноцитов человека HaCaT, а также культуры  первичных кератиноцитов, постнатальных фибробластов и стро­мальных клеток жировой ткани человека. Для оценки пролифе­ративной активности клеток использовали МТТ-тест. Клетки пас­сировали на 96-ти луночное плато в концентрации 30 тыс. клеток/ мл по 200 мкл в лунку. На следующий день среду меняли на среду  с добавлением эритропоэтина. По истечении трех-пяти дней про­водили МТТ-тест. Матричный раствор МТТ добавляли в каждую  лунку 96-ти луночного плато в соотношении 1:10 по отношению  к объему ростовой среды. Инкубировали 3-4 часа при 37ºС и 5%  СО2 и насыщенной влажности (в СО2-инкубаторе). После этого  жидкость удаляли из лунок осторожно, чтобы не повредить об­разовавшиеся нерастворимые в водной среде кристаллы формаза­на. Добавляли в каждую лунку по 100 мкл DMSO для растворения  кристаллов. Осторожно пропипетировали до получения гомоген­ного окрашивания. Оптическую плотность считали в режиме ABS  на планшетном спектрофотометре, используя фильтр на 540-590  nm в качестве основного, и на 630-690 nm в качестве корректирую­щего. Для оценки влияния эритропоэтина на интенсивность роста  культуры первичных кератиноцитов использовали окрашивание  красителем Гимза после фиксации 700 этанолом. Функциональ­ную активность фибробластов оценивали по степени контракции  (сжатия) коллагенового геля, в который вносили клетки в кон­центрации 200 тыс. клеток/мл. В среду добавляли эритропоэтин.  Диапазон исследованных концентраций эритропоэтина составил  в среднем от 20 мкг/мл до 50 нг/мл.

Результаты и обсуждение: Проведенные исследования пока­зали, что эритропоэтин во всех исследованных концентрациях  не оказывал токсического действия на клеточные культуры, а в  концентрациях от 350 до 700 нг/мл оказывал умеренное стимули­рующее влияние (около 20%) на пролиферацию эпидермальных  клеток человека. В тех же концентрациях он незначительно сти­мулировал пролиферацию постнатальных фибробластов и стро­мальных клеток жировой ткани (от 5 до 12%). В концентрациях от  700 нг/мл до 1 мкг/мл стимулировал контракцию коллагенового  геля постнатальными фибробластами человека. Полученные ре­зультаты согласуются с данными литературы, указывающими на  стимулирующий и антиапоптотический эффект эритропоэтина в  ходе заживления ран.

Выводы: Рекомбинантный эритропоэтин человека повышает  пролиферативную и функциональную активность клеток кожи  человека в культуре. Мы предполагаем, что эритропоэтин in vivo  может стимулировать регенеративные процессы в коже.