Разработка тест-систем для идентификации мутантных штаммов mycoplasma hominis методом полимеразной цепной реакции

Евстигнеева Н.П., Сергеев А.Г., Кузнецова Ю.Н., Резайкин А.В.

ФГУ «УрНИИДВиИ», Екатеринбург ГОУ ВПО «УРАЛЬСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ РОСЗДРАВА», г. Екатеринбург

Вопрос о том, какие условия являются решающими для реализации патогенного потенциала M. hominis, до настоящего времени остается невыясненным. Логично предположить существование наряду с условно­патогенными патогенных штаммов бактерий данного вида. В результате молекулярно-генетического анали­за штаммов M. hominis, выделенных в диагностически значимых титрах (104 и более КОЕ/мл) от 59 пациен­ток, в 29 случаях (49, 2%) была выявлена ранее не описанная мутация — замена тимина на цитозин в позиции 204 гена 16 S рРНК (позиция указана по последовательности NC_013511 в GenBank). Проведенные исследова­ния показали, что штаммы M. hominis, имеющие мутацию в гене 16 S рРНК, обладают более высоким патоген­ным потенциалом, в большинстве случаев ассоциированы с воспалительными заболеваниями верхних отделов урогенитального тракта: эндометритом, сальпингоофоритом и/или спаечным процессом по сравнению с «ди­кими» немутантными штаммами, что требует дифференцированного подхода к лечению.

Целью дальнейшего исследования явилась разработка тест-систем для идентификации мутантных штам­мов Mycoplasma hominis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Результаты. Представлялось целесообразным реализовать два подхода к конструированию тест-систем: 1) амплификация выбранного участка ДНК с последующим рестрикционным анализом и 2) ПЦР с использовани­ем праймера, имеющего на 5’конце основание, комплементарное 204 нуклеотиду мутантных штаммов. Для про­ведения реакции рестрикции амплифицированной ДНК была выбрана рестрикционная эндонуклеаза Fsp4 HI. У штаммов, не имеющих мутации, после обработки рестриктазой образуются два фрагмента ДНК размером 153 и 246 пар оснований (п.о.) (патент № 2386695 от 20.04.2010 «Способ дифференциации штаммов бактерий по гену рибосомальной РНК»). Для мутантных штаммов характерно образование трех фрагментов ДНК разме­ром 153, 144 и 102 п.о. Разработка тест-системы для идентификации мутантных штаммов Mycoplasma hominis методом ПЦР без последующего рестрикционного анализа основана на использовании феномена высокоспеци­фичного взаимодействия праймеров с матричной ДНК, позволяющей различать штаммы Mycoplasma hominis, имеющие различную структуру гена, кодирующего 16 S субъединицу рРНК. Для штаммов, имеющих мутацию, характерно образование одного фрагмента ДНК размером 158 п.о., в то время как у штаммов, не имеющих му­тации, не происходит амплификации ДНК.