Одной из современных тенденций медицины и дерматологии, в частности, является широкое внедрение в практику неинвазивных методов диагностики. К таким методам относятся ультразвуковое исследование кожи 1, оптическая когерентная томография 2, 3, ядерно-магнитный резонанс 4, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 5. Каждый из этих методов позволяет проводить морфологическую оценку кожных покровов в норме и при патологических состояниях. Преимущества неинвазивных методов исследования перед традиционной биопсией заключаются в возможностях быстрого получения результатов анализа кожи и многократного обследования одного и того же участка кожного покрова, безопасности для врача и пациента, безболезненном проведении процедуры без повреждения кожного покрова. Среди неинвазивных методов наибольшей разрешающей способностью обладает прижизненная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (ПКЛСМ). С помощью этого метода можно получить изображения кожи с разрешением, приближенным к обычной световой микроскопии.

Первое сообщение об использовании ПКЛСМ для получения изображения кожи человека с помощью отражения появилось в 1995 г. Основные работы по применению ПКЛСМ в дерматологии принадлежат исследователям США, Италии, Японии 6—8. В России работы по исследованию кожи in vivo с помощью метода ПКЛСМ не проводились.

Основной принцип конфокальной микроскопии — использование точечного источника света, освещающего маленький участок внутри ткани, с последующим улавливанием отраженного света через оптически соединенную апертуру (вкрапление). Отраженный свет проходит через апертуру, в результате чего только находящийся в фокусе свет достигает детектора, в то время как свет вне фокуса отклоняется. Таким образом, определяется только единственный план внутри образца, который расположен в фокусе (рис. 1).

Рисунок 1. Схема работы линз в конфокальном сканирующем лазерном микроскопе Vivascope 1500.

Числовая апертура линзы объектива, длина волны и размер открытой апертуры (вкрапления) определяют разрешение изображения, получаемого с помощью ПКЛСМ. Лазеры различных длин волн могут быть использованы в качестве источника света для отражающей конфокальной микроскопии. Более длинные волны, близкие к инфракрасным, проникают глубже в кожу, но дают более низкое разрешение, сравнимое с таковым коротких волн видимого спектра. Отражение света возникает в результате локального различия в коэффициенте преломления внутри ткани (для отдельных органелл или структур). Меланосомы дают сильное отражение с длинами волн видимого (400—700 нм) и близкого инфракрасного (700—1064 нм) спектров, поэтому клетки, содержащие меланин, такие как базальные кератиноциты и меланоциты, изображаются ярко.

С помощью метода ПКЛСМ можно не только получить изображения придатков кожи, но и отличить клетки различных слоев эпидермиса, волокна сосочкового слоя дермы, оценить состояние капилляров дермы.

Кроме определения размера, формы, возможно исследование морфологии разных клеток. ПКЛСМ позволяет делать оптические тончайшие срезы кожи с высокой контрастностью и высоким разрешением изображения. В дерматологии именно такая микроскопия может стать одним из основных неинвазивных диагностических методов, а также методов контроля лечения. Необходимо отметить, что в отличие от традиционной гистологии конфокальная лазерная микроскопия позволяет получать оптические срезы в плоскости, параллельной поверхности кожи (en face), что затрудняет объективное сравнение этих методов, но дает возможность более точно оценивать толщину различных слоев.

Понятие «нормы» очень важно для изучения различных патологий с помощью ПКСЛМ. К тому же, для России это новый метод, и начинать стоит с изучения условно здоровой кожи. В зарубежной литературе были отмечены несколько исследований здоровой кожи с помощью данного метода 6, 9, 10, но не было найдено общей базы данных топографии нормальной кожи с цифровыми показателями, полученными с помощью ПКСЛМ. В этой статье были изучены различные параметры кожи на разных участках кожного покрова.

Материал и методы

В исследовании приняли участие 20 здоровых добровольцев (5 мужчин и 15 женщин) с различными фототипами по Фицпатрику (10 человек со II фототипом и 10 — с III), в возрасте от 18 до 38 лет (средний возраст 27±2 года) без вредных факторов, связанных с работой на открытом воздухе. У каждого участника исследования выяснялась инсоляция за последние полгода: 13 человек загорали в последние полгода. Исследование проводилось после получения письменного информированного согласия от каждого пациента.

Изучены три разные области кожного покрова у каждого пациента. Области выбирали в зависимости от степени воздействия инсоляции: лоб, область декольте и внутренняя сторона предплечья.

Использовали один из последних конфокальных микроскопов (Vivascope 1500, Lucid Inc, США). Система Vivascope 1500 представляет собой клинический конфокальный микроскоп, предназначенный для использования в медицинских целях. Этот микроскоп может получать изображения клеток в реальном времени, слой за слоем, как на живой, так и на иссеченной ткани (рис. 2).

Рисунок 2. Фотография микроскопа Vivascope 1500.

В микроскопе используется диодный лазер с длиной волны 830 нм и мощностью не более 28 мВт на поверхности кожи. Лазерный луч выходит из кончика объектива микроскопа, полный угол расхож­дения лучей 128°. В качестве иммерсионной среды между линзой объектива и адгезивным окошком использовали плотный гель для ультразвука (Sonogel, Vertriebs, Германия), а между окошком и тканью — специальное косметическое масло (Contacting agent STS, Mavig, Германия) с оптимальным индексом рефракции. Данный прибор позволяет прижизненно сканировать кожу на глубину до 250 мкм. Размер каждого полученного изображения на экране составляет 500x500 мкм. Сканирование проходит с помощью 30-кратного иммерсионного объектива с фокусным расстоянием 5,3 мм.

Толщину слоев кожи измеряли с помощью получения оптических срезов по оси Z микроскопа пошагово на глубину 2—5 мкм от поверхности рогового слоя (оптический «ноль») до первых клеток зернистого слоя с крупными ядрами, затем вглубь до верхушек дермальных сосочков и, наконец, до основания сосочков и слоя коллагеновых волокон (рис. 3). Измерения каждого параметра повторяли не менее 5 раз в одном поле исследования, после чего выводили средние арифметические показатели для каждого участка кожного покрова. Таким образом, измеряли следующие параметры на каждом участке: средняя толщина рогового слоя, средний диаметр первых клеток зернистого слоя, средняя минимальная толщина эпидермиса (от оптического «нуля» до появления на экране первых окружностей клеток базального слоя вокруг верхушек сосочков дермы), количество дермальных сосочков на единицу площади в поле обзора, глубина залегания капилляров с видимым кровотоком в сосочковом слое дермы (от поверхности рогового слоя), средний диаметр просвета сосудов (измеряли только поперечные срезы сосудов, по форме напоминающие круги), средняя глубина расположения сетчатой системы коллагеновых волокон.

Рисунок 3. Показаны схематично конфокальные снимки горизонтальных оптических срезов по осям XY и их отличия по вертикальной оси Z.

Примечание. Представлены снимки рогового, зернистого, шиповатого и базального слоев эпидермиса, а также верхушек дермальных сосочков, просветы капилляров. Ось Y расположена перпенди­кулярно плоскости рисунка 11.

Визуальный анализ срезов. На рис. 4 представлены примеры оптических срезов условно здоровой кожи, сделанных с помощью ПКСЛМ в глубину по вертикальной оси Z. Для определения «оптического ноля» на поверхности рогового слоя ориентируемся на появление первых клеток в центре светового круга отражения линзы объектива. На рис. 4, а видна структура рогового слоя с дерматоглифом. Слой образуют безъядерные плотно прилегающие друг к другу клетки с четкими контурами, поверхность слоя довольно грубая, с высоким уровнем рефракции.

Рисунок 4. Конфокальные снимки различных слоев кожи (фототип III). Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. а — темные полосы дермоглифа на поверхности кожи;

Рисунок 4. Конфокальные снимки различных слоев кожи (фототип III). Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. б — крупные кератиноциты зернистого слоя.

Рисунок 4. Конфокальные снимки различных слоев кожи (фототип III). Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. в — мелкие клетки шиповатого слоя;

Рисунок 4. Конфокальные снимки различных слоев кожи (фототип III). Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. г — гранулы меланина в верхней части базального слоя эпидермиса (яркие скопления);

Рисунок 4. Конфокальные снимки различных слоев кожи (фототип III). Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. д — верхушки сосочков в сосочковом слое дермы;

Рисунок 4. Конфокальные снимки различных слоев кожи (фототип III). Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. е — петли капилляра с видимым кровотоком;

Рисунок 4. Конфокальные снимки различных слоев кожи (фототип III). Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. ж — скопления коллагеновых волокон в глубоких слоях дермы.

На рис. 4, б представлены первые живые клетки зернистого слоя. Главной отличительной чертой данного слоя являются кератиноциты с крупными темными ядрами, круглые, не очень плотно прилегающие друг к другу, с тонкой светлой цитоплазмой. Верхние участки зернистого слоя располагаются на глубине от 5 до 25 мкм. Как правило, структура цитоплазмы немного зернистая из-за наличия органелл и других микроструктур в клетке.

Затем появляется шиповатый слой, отличающийся скоплениями мелких клеток с более толстой цитоплазмой (рис. 4, в). В отличие от зернистого слоя расположение кератиноцитов шиповатого слоя напоминает соты. Ядра округлые и мелкие. Клетки шиповатого слоя располагаются на глубине от 15 до 47 мкм.

На оптических срезах верхней части базальной мембраны появляются яркие гранулы меланиновых «шляпок» (рис. 4, г). Как правило, они располагаются над ядрами кератиноцитов и особенно часто определяются у людей с третьим фототипом, которые подвергались инсоляции в последние полгода. Кератиноциты базального слоя более яркие, чем клетки шиповатого слоя, округлой формы, с более мелкими ядрами, расположены на глубине от 28 до 52 мкм.

С увеличением глубины срезов отмечается появление верхушек сосочкового слоя дермы (рис. 4, д) на глубине от 32 до 58 мкм.

Как правило, это темные округлые формы, окруженные несколькими слоями кератиноцитов базальной мембраны. Ориентиром для определения толщины эпидермиса здоровой кожи служили первые срезы верхушек сосочков. Более глубокие срезы сосочкового слоя дермы позволяли наблюдать кровоток в петлях капилляра, расположенных в центре каждого сосочка на глубине от 40 до 102 мкм (рис. 4, е). Также на срезах наблюдались структуры сетчатого слоя дермы, в более глубоких слоях представленные скоплениями волокон коллагена на глубине от 72 до 140 мкм (рис. 4, ж).

Качественная оценка топографических изменений слоев кожи. Снимки рогового слоя в зонах, чаще подвергающихся солнечному излучению (лоб и область декольте), были более яркими (рис. 5). Сравнение было сделано на разных участках кожи одного пациента с использованием лазера одинаковой мощности.

Рисунок 5. Конфокальный снимок поверхности рогового слоя. Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. а — в области лба (снимок сделан на глубине 4,88 мкм с мощность лазера 2,8 мВт. Поверхность рогового слоя более яркая, более четко выраженный дермоглиф);

Рисунок 5. Конфокальный снимок поверхности рогового слоя. Измерительная линейка 1 см = 90 мкм.

Примечание. б — в области тыльной поверхности предплечья (глубина среза 5,02 мкм, мощность лазера 2,8 мВт, поверхность более гладкая, менее выражен рисунок дермоглифа).

При сравнении структуры сосочкового слоя дермы в этих зонах было отмечено, что в областях кожного покрова, чаще подвергающихся солнечному излучению, среднее количество сосочков на единицу площади выше, сосочки разные по диаметру, средний диаметр просвета сосудов меньше (рис. 6). На коже в области тыльной стороны предплечья, где кожа больше защищена от прямых лучей солнца, количество сосочков на каждом снимке было меньше, они были более схожи по диаметру, а сосуды более крупные по диаметру (рис. 7).

Рисунок 6. Сосочковый слой дермы в области декольте на глубине 106,81 мкм, мощность лазера 10 мВт.

Примечание. Видны сосочки разного диаметра и формы, окруженные яркими клетками базальной мембраны. Линейка 1 см = 90 мкм.

Рисунок 7. Сосочковый слой кожи предплечья на глубине 76,12 мкм, мощность лазера 9,3 мВт.

Примечание. Линейка 1 см = 90 мкм.

Изображения слоя коллагеновых волокон также отличались в разных областях кожного покрова (рис. 8, 9). На коже лба и груди, как правило, коллагеновые волокна были более скопленными, образовывали пучки, тогда как в области предплечья волокна располагались более равномерно.

Рисунок 8. Кожа лба на глубине 121,13 мкм, мощность лазера 24,3 мВт.

Примечание. Видны светлые скопления коллагеновых волокон, образующие пучки. Линейка 1 см = 90 мкм.

Рисунок 9. Кожа тыльной стороны предплечья на глубине 91 мкм, мощность лазера 26,5 мВт.

Примечание. Волокна коллагена распределены более равномерно, яркие скопления и пучки волокон малочисленны. Линейка 1 см = 90 мкм.

Оценка возрастных изменений кожи. Средняя толщина рогового слоя у лиц моложе 30 лет была меньше, чем у группы пациентов старше 30 лет, тогда как толщина дермы уменьшалась с возрастом. Особенно такая тенденция отмечалась в зоне лба и груди, где кожа легче подвергается солнечному излучению и фотостарению. Были отмечены возраст­ные изменения структуры сосочков дермы. У лиц старше 30 лет, а также у лиц, чаще подвергавшихся инсоляции, сосочки дермы по форме были более вытянуты, более уплощенные по высоте, сосочковый слой дермы был истончен (рис. 10, 11).

Рисунок 10. Сосочковый слой дермы у пациентки 22 лет в области груди на глубине 59,85 мкм, мощность лазера 10 мВт.

Рисунок 11. Сосочковый слой дермы у пациентки 38 лет, в области груди на глубине 65,95 мкм, мощность лазера 9,5 мВт.

Примечание. Линейка 1 см = 90 мкм.

Из общей картины в группе моложе 25 лет выделяются показатели одного восемнадцатилетнего пациента. Из анамнеза ясно, что он 2 раза в год подвергается инсоляции в условиях тропического пустынного климата без фотозащиты. У него сильно увеличена толщина рогового слоя, сосочки вытянутые, дерма истончена, волокна коллагена образуют плотные пучки на всех участках кожного покрова (возможное фотостарение).

Количественный анализ топографических изменений. Изменения толщины слоев кожи, а также размеры клеток и плотность расположения сосочков были рассчитаны и сложены в таблицу для наглядного сравнения (табл. 1—3). Согласно приведенным данным, толщина рогового слоя в области груди и лба превосходит толщину рогового слоя в защищенных от солнца областях, таких как тыльная сторона предплечья. В то же время толщина рогового слоя увеличивается с увеличением возраста на всех участках кожи. При сравнении толщины дермы на разных участках кожного покрова также можно отметить, что она значительно толще в области лба и груди, но важно выделить ее значительное истончение в этих участках с возрастом. Таким образом, можно предположить, что вытягивание сосочков дермы с увеличением возраста (см. рис. 11) свидетельствует об истончении сосочкового слоя и о выравнивании его рельефа. Количество сосочков на единицу площади в области предплечья значительно меньше участков на коже лба и груди, причем наибольшие значения имеют место в области декольте.

Таблица 1. Результаты исследования у лиц моложе 25 лет*

Примечание. ТРС — средняя толщина рогового слоя; КЗС — средний диаметр клеток зернистого слоя в верхней части; МТЭ — минимальная толщина эпидермиса; КС — количество сосочков на единицу площади (на экране микроскопа); ГК — средняя глубина расположения капилляров с видимым кровотоком; ДС — средний диаметр просвета сосудов; КВ — средняя глубина расположения коллагеновых волокон. * — инсоляции в последние полгода подвергались в 50% случаев.

Таблица 2. Результаты исследования у лиц в возрасте 25—34 года*

Примечание. Примечание. Сокращения см. в табл. 1.* — инсоляция в 67% случаев.

Таблица 3. Результаты исследования у лиц старше 35 лет*

Примечание. Сокращения см. в табл. 1.* — инсоляция в 100% случаев.

Затруднение вызвала оценка диаметра петель капилляров в сосочковом слое дермы, так как срезы могли проходить как вдоль, так и поперек сосуда. Учитывали только округлые срезы в центре сосочков с видимым кровотоком. Можно отметить, что с увеличением возраста диаметр сосудов кожи уменьшается.

Обсуждение

Прижизненная конфокальная сканирующая лазерная микроскопия — неинвазивный метод, позволяющий подробно изучать строение кожи без разрезов и повреждений. С помощью данного метода изучается множество различных патологий 11—13. Однако важно интерпретировать полученные данные на основе параметров здоровой кожи. В этой статье проанализированы некоторые морфометрические данные с помощью ПКСЛМ, при этом проводилось сравнение их на различных участках кожи в зависимости от возраста и защиты от солнечного излучения. Были получены оптические срезы в плоскости сечения, параллельной поверхности кожного покрова, т.е. en face, что отличает этот метод от традиционной гистологии.

То, что роговой слой оказался ярче, с более выраженным дермоглифом на участках кожи, подверженных постоянному солнечному излучению, может быть объяснено защитной реакцией кожи 6. Более того, у людей с III фототипом чаще отмечаются яркие скопления гранул над базальной мембраной. Используя информацию из зарубежной литературы 9, 14, можно предположить, что это и есть защитные меланиновые «шляпки», расположенные над ядрами кератиноцитов. Было выявлено, что с увеличением возраста толщина рогового слоя увеличивается, особенно на участках кожного покрова с частой инсоляцией.

При сравнении структуры сосочкового слоя было выявлено, что в областях кожного покрова с частой инсоляцией среднее количество сосочков на единицу площади выше, диаметр сосочков сильно различался, а средний диаметр просвета сосудов меньше, чем на участках кожи, защищенных от прямых лучей солнца. Более того, были отмечены возрастные изменения структуры сосочков дермы.

С увеличением возраста сосочки дермы вытягиваются, уплощаются по высоте, сосочковый слой дермы истончается. Похожие признаки были обнаружены и у одного пациента 18 лет, что может свидетельствовать о преждевременном фотостарении, так как пациент несколько раз в год подвергался инсоляции без фотозащиты. Изображения слоя коллагеновых волокон также отличались в разных областях кожного покрова (см. рис. 8, 9). Обнаруженные данные коррелируют с найденными в зарубежной литературе показателями.