В настоящее время господствующим является мнение, что в природе не существует сколько-нибудь значимого резервуара возбудителя лепры, имеющего эпидемиологическое значение, а единственным источником инфекции является больной человек. Однако такое постулирование не позволяет ответить на ряд вопросов практической лепрологии. Не выяснены причины «высокой» первичной заболеваемости лепрой при 100% охвате больных комбинированной противолепрозной терапией. Нет объяснения возникновению «спонтанных» случаев лепры, когда источник инфекции выявить не удается. Нет достаточно веских аргументов для объяснения преобладания лепроматозного типа лепры при угасании эндемии. Сложно объяснить причины инфицированности броненосцев в США, обезьян в Заире и определить значение этих животных в поддержании инфекции в данной местности. Остаются невыясненными пути передачи и входные ворота инфекции, а также причины существования эндемичных по лепре регионов.

Гипотетически многие вопросы становятся разрешимыми, а особенности лепры понятными, если предположить, что Mycobacterium leprae способны автономно существовать вне организма хозяина в окружающей среде.

Еще в конце XIX века Biedencap, Beaven-Racke, Lutz высказывали предположения о возможности заражения лепрой из окружающей среды, однако все они были чисто умозрительными (цит. по Д.Ф. Решетилло [1]).

Мы в своей работе исходили из гипотезы, что культивируемые почвенные микобактерии, называемые M. «lufu», являются возбудителем лепры.

Целью настоящего исследования явилась демонстрация биологических свойств M. «lufu», общих с таковыми у M. leprae, для подтверждения выдвинутой гипотезы, что M. «lufu» являются внеорганизменной частью популяции M. leprae.

Культура M. «lufu» была получена Институтом по изучению лепры в 1981 г. от проф. J. Seydel (ФРГ) при содействии ВОЗ.

M. «lufu» были впервые выделены из почвы в Заире в 1980 г. F. Portaels [2]. Они охарактеризованы как сапрофитные, медленно растущие кислотоустойчивые микобактерии. Таксономическое положение M. «lufu» не определено. M. «lufu» обладают чувствительностью к действию сульфоновых препаратов, сопоставимой с таковой у M. leprae [3, 4].

Известно, что до настоящего времени не существует методов культивирования M. leprae in vitro, хотя работы по получению культур не прекращаются со времени открытия возбудителя G. Hansen в 1874 г. [5]. Периодически в литературе появляются сообщения об успешном культивировании микобактерий, выделенных из пораженных тканей больных лепрой людей [6-8]. Обычно такие культуры различаются по своим биологическим свойствам и, как правило, в дальнейшем их принадлежность к M. leprae не подтверждается. Для утверждения, что полученные из «лепрозных источников» культивируемые микобактерии действительно являются M. leprae, в соответствии с требованиями ВОЗ [9] эти микобактерии должны иметь следующие свойства.

1. Кислотоустойчивость и морфологические особенности (размеры, форма и окрашивание) такие же, как и у M. leprae, выделенных от нелеченых больных лепроматозной лепрой.

2. Способность размножаться в предлагаемых авторами условиях культивирования.

3. Невозможность культивирования на обычных питательных средах, в том числе и на средах, которые применяются для культивирования M. tuberculosis и других микобактерий, например на среде Левенштейна-Йенсена.

4. Способность размножаться в подошве лапы иммунологически нормальных мышей в характерной манере: со временем удвоения в период логарифмической фазы размножения, равным 10-15 сут, и максимальным количеством, достигающим у мышей линии СВА 1·106 - 1·106,3 микробных тел в подошве лапы через 6-10 мес.

5. Размножение в организме мыши должно тормозиться при постоянном назначении животным дапсона с пищей в концентрации 0,0001 г на 100 г корма, в том случае, если данный штамм M. leprae чувствителен к дапсону.

6. Вызывать реакцию Митсуды диаметром более 10 мм у больных туберкулоидной лепрой и не вызывать таковую у больных лепроматозной лепрой при внутрикожном введении микроорганизмов в дозе 1·106 - 1·107,2 в 0,1 мл раствора.

7. Вызывать характерные поражения в инокулированной задней лапе бестимусных мышей или мышей с другим иммунным дефектом через 12-18 мес после заражения исследуемыми микроорганизмами.

8. Содержать в ДНК 56% гуанинина + цитозина.

9. Обладать гомологией по ДНК с аутентичными M. leprae, равной 70%, в оптимальных условиях реассоциации.

10. Наличие миколевых кислот и пептидогликанов, характерных для M. leprae.

11. Наличие специфического для M. leprae пептидогликана и других антигенов или эпитопов, демонстрируемых в ходе реакции со специфическими моноклональными антителами.

Нами был проведен ряд исследований, в том числе и в рамках тестов, рекомендованных ВОЗ, с использованием в качестве объекта M. «lufu».

Изучение морфологических характеристик M. «lufu» показало, что они представляют собой грамположительные кислотоустойчивые палочки, дающие при люминесцентной микроскопии золотистое свечение. Размеры M. «lufu» составляют от 1 до 5 мкм в длину и около 0,3-0,5 мкм в диаметре. Однако встречались и более длинные формы, достигающие в длину до 10 мкм [10]. Данная характеристика соответствует пункту 1 требований ВОЗ.

В опытах in vivo была установлена способность M. «lufu», выращенных на среде Левенштейна-Йенсена, размножаться в подушечках лап мышей при интраплантарном заражении по методу C. Shepard [11]. Через 9 мес после заражения количество микобактерий в месте инокуляции увеличилось с 1·104 до 4,58±0,3·105. Интраплантарное размножение микобактерий полностью подавлялось диафенилсульфоном, вводимым животным с кормосмесью в течение всего эксперимента в дозе 0,01%.

Ранее нами было показано стимулирующее действие синтетического тетрапептида тафцина на размножение M. leprae и генерализацию патологического процесса при моделировании лепрозной инфекции [12]. С целью стимуляции развития инфекции группе животных при заражении по методу C. Shepard в составе суспензии M. «lufu» вводили тафцин. При заражении мышей на фоне действия тафцина через 17 мес M. «lufu» вызывали генерализованный патологический процесс с образованием во внутренних органах животных гранулем, которые по своим морфологическим характеристикам были сходны с гранулемами, возникающими при лепроматозном типе лепры у броненосцев и человека [13]. Макроскопически наиболее выраженные изменения отмечались главным образом в селезенке, печени и легких. При гистологическом исследовании в селезенке вокруг лимфатических фолликулов и в красной пульпе отмечались инфильтраты, состоящие из сливающихся гранулем, представленных крупными макрофагами. В цитоплазме макрофагов содержалось большое количество кислотоустойчивых микобактерий и фуксинофильных зерен. В печени наблюдались аналогичные гранулемы, расположенные по ходу центральных вен, в строме портальных трактов, а также в средних зонах печеночных долек. Кроме макрофагов, в состав гранулем входило небольшое количество лимфоцитов и гистиоцитарных элементов, а также фибробластов, ограничивающих гранулемы от окружающих тканей. В легких воспалительный процесс носил характер сегментарного (долевого) продуктивного пульмонита. При этом альвеолы и перегородки были густо инфильтрированы крупными макрофагами, содержащими в цитоплазме кислотоустойчивые микобактерии.

Посев патологического материала из органов и подушечек лап зараженных животных на среде Левенштейна-Йенсена роста M. «lufu» не давал, что является, на наш взгляд, весьма важным фактом. Видимо, в микобактериях происходят изменения, в результате которых они теряют способность расти на искусственных питательных средах даже после первого пассажа на животных.

Анализ результатов эксперимента позволяет утверждать, что M. «lufu» соответствуют критериям, разработанным ВОЗ (пункты 2-5; 7), характеризующим культивируемые микобактерии как M. leprae.

Таким образом, получены экспериментальные доказательства (морфологический субстрат заболевания - макрофагальные гранулемы) патогенности M. «lufu», т.е. их способности распространяться во внутренних органах животных и вызывать лепроподобный патологический процесс, идентичный процессу, развивающемуся при аналогичных условиях ( на фоне действия тафцина) у мышей, зараженных M. leprae [13].

Поскольку наличие ДОФА-оксидазной активности в микобактериальных клетках также является одним из тестов идентификации M. leprae, одобренных и рекомендованных ВОЗ, мы биохимическими и электронно-цитохимическими методами определяли ДОФА-оксидазную активность у M. «lufu». В результате проведенных исследований было достоверно установлено наличие у M. «lufu» D-ДОФА-оксидазной активности. Методами электронной цитохимии была определена локализация фермента в микобактериальной клетке. На ультратонких срезах M. «lufu» обнаружено усиление электронной плотности «гомогенных телец», что является доказательством наличия в них ДОФА-оксидазы. Фермент-субстратные гранулы размером 10-50 нм обнаруживались и в цитоплазме бактериальных клеток, главным образом, около цитоплазматических мембран. Наличие D-ДОФА-оксидазной активности у M. «lufu» указывает на сходство M. «lufu» и M. leprae по данному параметру [14].

Сравнительный анализ M. «lufu» и M. leprae был также проведен методом иммуноблоттинга с помощью 6 клонов моноклональных антител (ML 06-A2 (12 кДа), L 5 (18 кДа), F 47-9 (36 кДа), III E 9, II H 9, IV D 8 (65 кДа), специфичных для M. leprae (банк ВОЗ). В качестве референс-препарата использовали водно-солевой экстракт из M. leprae, выделенных из ткани броненосца (банк ВОЗ). В результате исследования выявлен общий для M. «lufu» и M. leprae специфичный эпитоп, что свидетельствует об антигенном родстве M. «lufu» и M. leprae [15] и соответствует пункту 11 требований ВОЗ. При этом установлено, что M. «lufu» не реагировали в иммуноферментном анализе с моноклональными антителами, специфичными для атипичных микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса [16].

Кроме тестов, рекомендованных ВОЗ, нами был проведен ряд исследований, направленных на более глубокое изучение биологических свойств M. «lufu». В частности, показано, что на плотной среде Левенштейна-Йенсена M. «lufu» давали смешанный рост в виде светло-кремовых или светло-желтых R- и

S-колоний. Слабая пигментация не зависела от освещенности. Скорость роста составляла 5-7 сут. M. «lufu» росли при температуре 25°С и 37°С, при 45°С рост отсутствовал. При культивировании на среде Школьниковой отмечалось равномерное помутнение среды и наличие крошковидного осадка.

Культурально-биохимическая идентификация позволила установить, что M. «lufu» способны расти на среде с тиофен-2-карбоксил гидразидом и редуцировать нитраты в нитриты. Это соответствует положительному ниациновому тесту и выделяет M. «lufu» из ряда известных атипичных микобактерий. Сравнение M. «lufu» с известными 27 медленнорастущими и 33 быстрорастущими видами микобактерий по 20 параметрам не выявило их принадлежности к какому-либо из этих видов. Наиболее близки M. «lufu» к M. fortuitum, однако последние отличаются ниацинотрицательностью, способностью к деградации ПАСК и гидролизу Tвин-80.

При отсутствии выраженного пигментообразования M. «lufu» могут принадлежать к III группе нефотохромогенных микобактерий (по классификации Runyon). Это подтверждается и особенностями термостабильности каталазы M. «lufu». Ниацинположительные M. tuberculosis при наличии у них активной каталазы после прогревания теряют ее. У атипичных микобактерий I, II и IV групп каталаза после прогревания не разрушается и ее активность сохраняется резко выраженной. У микобактерий III группы реакция на термостабильность каталазы, как правило, слабоположительная, что наблюдается и у M. «lufu» [13].

Изучен белковый спектр M. «lufu» по электрофореграммам, полученным с помощью вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия по методу U. Laemmli [17]. Показано отсутствие высокомолекулярного триплета, характерного для патогенных микобактерий, и наличие выраженных фракций в зоне среднемолекулярных белков, не свойственных для кислотоустойчивых сапрофитов. Данное обстоятельство позволяет предположить, что M. «lufu» относятся к группе условно-патогенных микобактерий [18]. Эти данные сопоставимы с результатами наших экспериментов in vivo, где патологический процесс у животных, зараженных M. «lufu», формировался только при воздействии синтетического тетрапептида тафцина.

Нами была поставлена задача изучить протективные свойства M. «lufu» при экспериментальной лепрозной инфекции, а также провести сравнительное изучение протективных свойств M. «lufu» и микобактерий, используемых в качестве вакцины при лепре в настоящее время (БЦЖ, M. leprae, M. vaccae). Установлено, что препараты из M. «lufu» обладают выраженной способностью задерживать размножение M.leprae в подушечках лап мышей, зараженных по методу Shepard. Максимальные показатели протективности были получены при однократной внутрикожной или внутрибрюшинной вакцинации мышей препаратами из M. «lufu» за 28 дней до заражения их M. leprae. Влияние кратности введения на протективные свойства M. «lufu» несущественно. Сравнительная оценка протективных свойств M. «lufu» с другими микобактериальными препаратами показала, что эффективность протективного действия M. «lufu» выше, чем у вакцины БЦЖ, M. vaccae, живых и убитых M. leprae [19, 20].

Нами была разработана тест-система на основе иммуноферментного анализа (ИФА) для серодиагностики лепры с использованием в качестве тест-антигена препаратов из M. «lufu». Постановку ИФА осуществляли на полистироловых планшетах, используя непрямой вариант анализа по общепринятой методике. Планшеты сенсибилизировали антигенами из M. «lufu» и M. leprae. Исследовали сыворотки от больных лепрой в активной стадии заболевания и с регрессом лепрозного процесса, больных туберкулезом, сифилисом, с острыми инфекционными и кожными заболеваниями. В качестве контроля использовали сыворотки от здоровых доноров. Установлено, что в группе больных с активными проявлениями лепрозного процесса средний уровень антител значительно превышал фоновый уровень в случае использования антигена как из M. «lufu», так и из M. leprae. Средний уровень антител к M. «lufu» и M. leprae у больных лепрой с регрессом заболевания не превышал фоновых значений также, как и в группах больных с другими заболеваниями и у доноров. При тестировании сывороток больных с активным туберкулезом можно было ожидать повышение показателей оптической плотности (ОП) за счет антител к перекрестно реагирующим антигенам M. leprae и M. tuberculosis, однако и в этой группе больных средние показатели ОП не превышали фоновых значений. Таким образом, результаты, полученные в тест-системе с M. «lufu», полностью сопоставимы с результатами тест-системы с M. leprae. Сравнительная оценка изучаемых тест-систем показала, что при 100% диагностической чувствительности обе тест-системы сопоставимы по диагностической специфичности и эффективности [21, 22]. Аналогичный подход был использован для разработки неинвазивного метода диагностики лепры, основанного на поиске антител к M. leprae в слюне с использованием в качестве антигена M. «lufu» [23, 24]. Полученные результаты показывают, что водорастворимые препараты из обработанных ультразвуком M. «lufu» и M. leprae содержат антигены, взаимодействующие в ИФА со сходными по специфичности антителами из слюны и сыворотки крови больных лепрой. Этот факт также свидетельствует об антигенном родстве M. «lufu» и M. leprae.

Совокупность характеристик, полученных в результате проведенных исследований, а именно: кислотоустойчивость и морфологические особенности, такие же как и у M. leprae, выделенных от нелеченых больных лепроматозной лепрой, размножение в подошве лапы иммунологически интактных мышей с увеличением через 9 мес числа микобактерий в 50 раз, неспособность расти после первого пассажа на животных на обычных питательных средах, в том числе и на среде Левенштейна-Йенсена, наличие сульфоночувствительности, сохраняющейся при пассировании на животных, способность вызывать на фоне действия иммуномодулятора лепроподобный патологический процесс, характеризующийся образованием во внутренних органах экспериментальных животных макрофагальных гранулем с наличием внутри макрофагов большого количества кислотоустойчивых микобактерий, выраженная ДОФА-оксидазная активность, наличие специфических антигенных детерминант, выявляемых моноклональными антителами к антигенам M. leprae - позволяет говорить не только об определенном родстве M. «lufu» и M. leprae, но и с большой долей вероятности заключить, что M. «lufu» являются внеорганизменной частью популяции возбудителя лепры.

Таким образом, мы имеем культуру микобактерий лепры, пригодную для использования при создании и совершенствовании диагностических и вакцинных препаратов при лепре, что и было продемонстрировано в наших работах.

Результаты проведенного исследования позволяют предположить, что после попадания в организм теплокровных животных (как было показано в экспериментах in vivo с M. «lufu») M. leprae теряют способность культивироваться на искусственных питательных средах даже после первого пассажа. Такая особенность возбудителя лепры в настоящее время рассматривается как неспособность M. leprae расти и размножаться вне организма хозяина.

Исходя из наших представлений о биологии возбудителя лепры, т.е. его способности автономно существовать во внешней среде независимо от наличия или отсутствия на данной территории восприимчивых к лепре животных или человека, мы можем иначе взглянуть и на эпидемиологию лепры. Если говорить об эндемичности лепрозной инфекции, то следует признать, что заболеваемость может поддерживаться не только за счет бактериовыделителей (людей или животных), но и за счет внеорганизменной популяции микобактерий, являющейся полноценной составной частью определенных экосистем. Ранее эту мысль мы уже высказывали [25]. A. Chakrabarty и S. Dastidar неоднократно высказывали предположение, что M. leprae являются почвенными хемоаутотрофами и могут существовать как в организме человека, так и в почве, которая, возможно, является альтернативным источником заражения [26, 27]. В местности, где больных лепрой достаточно много, заражение через почву, воду и т.д. конкурирует с другим путем передачи инфекции - от больного человека здоровому. В условиях спорадической заболеваемости возможность заражения из окружающей среды представляется более реальной, а может быть и единственной. В регионах с высокой заболеваемостью доминирующей является последовательная передача возбудителя от человека к человеку, и поэтому люди инфицируются адаптированным для человека штаммом M. leprae. По этой же причине в таких очагах наблюдается весь спектр заболевания - от лепроматозного до туберкулоидного. Микобактерии, живущие и размножающиеся в окружающей среде какого-либо региона и способные вызвать лепрозную инфекцию, не адаптированы к человеку и могут вызвать заболевание только у лиц с наиболее выраженной предрасположенностью к лепре. Этим, видимо, объясняется преобладание лепроматозного типа лепры при спорадической заболеваемости, поскольку общеизвестно, что тип лепры зависит не от вирулентности возбудителя, а от степени иммунного дефекта организма заболевшего. Увеличение инкубационного периода при спорадической заболеваемости также следует рассматривать как более длительный процесс адаптации возбудителя, проникшего из внешней среды в организм человека. Заражением из окружающей среды, возможно, объясняются и «спонтанные» случаи лепры и некоторые «рецидивы» болезни.

Таким образом, причины существования эндемичных по лепре регионов можно объяснить не только наличием больных лепрой людей, но и комплексом природных факторов, главным из которых является наличие свободноживущих в окружающей среде M. leprae (как части экосистемы), способных вызвать при определенных условиях у восприимчивых людей и животных лепрозную инфекцию.

Литература

Решетилло Д.Ф. Проказа. Ст-Петербург 1904;515.

Portaels F. Study of unclassified dapsone sensitive mycobacteria isolated from the environment in Zaire. Ann Soc Belge Med Trop 1980;60:381-386.

Portaels F. Taxonomic studies of mycobacteria belonging to the "M.lufu" group. XII International Leprosy Congress: Abstracts. New Delhi 1984;IV/220:A.

Seydel J.K., Wempe E.C. Bacterial growth kinetics of M. «lufu» in the presence and absence of various drugs alone and in combination. A model for the development of combined chemotherapy against M.leprae. Int J Lepr 1982;50:20-30.

Hansen G.A. Spedalskhedens Arsager. Norsk Magazin for Laegevidenskaben 1874;4:76-79.

Bapat C.V. Cultivation of Mycobacterium leprae: a new approach. Int J Lepr 1989;57:4:874-879.

Beaman B.L., Kwang-Shin Kim, Laneelle M.A., Barksdale L. Chemical characterization of organisms isolated from leprosy patients. J Bact 1974;117:3:1320-1329.

Chatterjee B.R., Roy R.D. Growth of Mycobacterium leprae in a redox system: III. Evidence of growth at low temperature (psychrophilia) and further refinement of growth medium. Ind J Lepr 1989;61:4:458-466.

Laboratory Techniques for Leprosy. Geneva (WHO) 1987;165.

Калянина О.В., Юшин М.Ю., Дячина М.Н. и др. Сравнительная культурально-биохимическая и иммунохимическая идентификация лабораторных штаммов культивируемых микобактерий из лепрозных поражений больных и почвы. Пробл туб 2000;5:49-52.

Shepard С.С. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice. J Exp Med 1960;112:445-454.

Вишневецкий Ф.Е., Фрейдлин И.С., Ющенко А.А. и др. Применение тафцина в экспериментальной лепрологии. Бюл экспер биол 1991;8:181-183.

Юшин М.Ю., Васильев А.Э., Калянина О.В. Изучение некоторых свойств M. lufu в опытах in vivo. Эпидемиология, клиника, диагностика, лечение и профилактика важнейших инфекционных болезней: Материалы.Тамбов- Астрахань 1994;137-138.

Юшин М.Ю., Маслов А.К., Бочановский В.А. и др. Биохимическое и электронно-цитохическое изучение ДОФА-оксидазной активности у M. lufu: Тезисы. Астрахань 1997;26.

Саламатина О.С., Дячина М.Н., Калинина О.А. и др. Выявление видоспецифических антигенных детерминант микобактерий лепры с помощью моноклональных антител. Актуальные вопросы дерматологии и венерологии: Сборник научных трудов. Астрахань 1998;115-117.

Саламатина О.С. Сравнительная характеристика антигенного состава микобактерий лепры и некоторых культивируемых микобактерий: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М 2000;22.

Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227:680-685.

Калянина О.В., Юшин М.Ю., Дячина М.Н. и др. Культурально-биохимическая и иммунохимическая характеристика лабораторных штаммов М.01, М.011 и M. lufu. Иммунодиагностика и иммунореабилитация при лепре, туберкулезе и других хронических заболеваниях: Материалы. Астрахань 1998;68-69.

Юшин М.Ю., Калянина О.В. Протективные свойства M. «lufu» при экспериментальной лепрозной инфекции. Пробл туб 1995;2:47-48.

Юшин М.Ю., Калянина О.В. Пат. #2135196. Способ иммунопрофилактики эксперементальной лепрозной инфекции. Изобретения 1999;24.

Юшин М.Ю., Дячина М.Н., Дегтярев О.В., Калянина О.В. Серодиагностика лепры с использованием антигена из M. «lufu». Иммунодиагностика и иммунореабилитация при лепре, туберкулезе и других хронических заболеваниях: Материалы. Астрахань 1998;35-39.

Юшин М.Ю., Дячина М.Н., Дегтярев М.Н., Калянина О.В. Пат. #2124730. Способ диагностики лепры. Изобретения 1999;1.

Юшин М.Ю., Дячина М.Н., Бочановский В.А., Ющенко А.А. Обнаружение антител к M. leprae в слюне больных лепрой. Клин лаб диагност 2005;1:52-54.

Дячина М.Н., Юшин М.Ю., Ющенко А.А., Бочановский В.А. Пат. #2171689. Способ диагностики лепры. Изобретения 2001;22.

Yushin M.Yu. A study of the biology of M. «lufu» and prospects for using it in leprosy investigation. Int J Lepr 2000;68:2:179-182.

Dastidar S.G., Chakrabarty A.N. A natural ecosystem for leprosy related chemoautotrophic nocardioform bacteria: transmission of leprosy bacillus to humans from fossil fuel rich soil. 14 International Congress: Abstracts. Orlando 1993;74A.

Chakrabarty A.N., Dastidar S.G. Is soil an alternative source of leprosy infection? Acta Lepr 2001-2002;12:2:79-84.