Технология биочипов в диагностике иппп

Галимов А.Р., Кожушная О.С., Фриго Н.В., Рахматулина М.Р., Шаталова А.Ю., Кубанов А.А.

ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», г. Москва

Цель. Разработать ДНК-чипы для одновременной идентификации облигатно-патогенных возбудителей ИППП, а также условно-патогенных возбудителей урогенитальных инфекций.

Материалы и методы. При проведении исследований использованы олигонуклеотидные зонды, распознающие уникальные последовательности в геномах определяемых облигатно-и условно-патогенных микроорганизмов, при­менены методы ПЦР, ДНК-гибридизации, технология «капилярной печати» на приборе Calligrapher MiniArrayer (Bio-Rad) и технология детекции флуоресцентного сигнала на поверхности ДНК-чипа на приборе Verse Array (Bio-Rad).

Результаты. На основе подбора специфических олигонуклеотидных зондов, узнающих уникальные вариа­бельные фрагменты 16 S РНК бактерий, а также уникальные фрагменты геномной ДНК вирусов герпеса и три­хомонады разработаны: ДНК-чип для одновременной идентификации в биологическом материале 7 облигатно­патогенных микроорганизмов-возбудителей ИППП (N. gonorrhoeae, C.traсhomatis, M. genitalium T.pallidum, T.vaginalis, Herpes virus I, Herpes virus II) и ДНК-чип для определения ряда условно-патогенных возбудителей урогенитальных инфекций (всего 21 микроорганизм) и непатогенных микроорганизмов. ДНК-чип представляет собой стеклянную пластинку с эпоксимодифицированной поверхностью для иммобилизации олигонуклеотид­ных зондов, содержащую 12 зон с зондами. Один ДНК-чип позволяет идентифицировать микроорганизмы одно­временно у 12 пациентов. Исследование на ДНК-чипе включает в себя следующие стадии: 1) выделение тоталь­ной ДНК из образца биоматериала; 2) проведение полимеразной цепной реакции с целью получения меченных флуорофором Су5 продуктов амплификации фрагментов геномов выбранных микроорганизмов; 3) проведение реакции гибридизации путем инкубации меченных флуорофором Су5 продуктов амплификации геномов иден­тифицируемых микроорганизмов на ДНК-чипе; 4) отмывка ДНК-чипа после окончания гибридизации и высуши­вание чипа; 5) регистрация результатов гибридизации с помощью многоканального сканера ДНК-чипов и анализ зоны гибридизации на наличие определяемых микроорганизмов в испытуемом биообразце.

Параллельная идентификация на ДНК-чипе 7 облигатно-патогенных, а также 21 условно-патогенного ми­кроорганизма в биологических образцах пациентов с подозрением на наличие ИППП позволяет сократить вре­мя комплексного обследования пациентов, идентифицировать трудно культивируемые микроорганизмы, повы­сить точность дифференциальной диагностики ИППП за счет расширения спектра определяемых микроорга­низмов, а также оценить состояние микробиоценоза мочеполовой сферы пациентов.

Заключение. Разработанные ДНК-чипы могут быть использованы для быстрой комплексной диагностики ИППП и других урогенитальных инфекций и полностью заменить бактериологические методы и ПЦР в клинико­диагностических лабораториях.